Preservative

Bagian II
PRESERVASI MIKROBIOLOGI INDUSTRI

1. FREEZING (Pembekuan)
Pembekuan merupakan metode preservasi mikroorganisme yang paling sederhana dan paling umum. Untuk pembekuan biasa tidak diperlukan alat khusus. Meskipun perlu ditambahkan cryoprotective agent untuk mendapatkan hasil yang memuaskan dengan metode pembekuan tersebut. Selain itu, suhu penyimpanan harus tetap dijaga dibawah -20C. Kerugian dari metode ini adalah kultur harus tetap dalam keadaan beku atau ditumbuhkan kembali pada agar miring selama transportasi.

A. Ordinary Freezing
Biakan cair atau sel yang dipanen dari biakan miring dibagi kedalam tabung atau vial dan disimpan dalam keadaan beku di dalam freezer dengan kisaran suhu antara –5 sampai -20C. Dengan cara ini viabilitas mikroorganisme dapat dipertahankan selama 1 – 2 tahun.

B. Ultracold-Temperature Freezing (-60 sampai -80C)
Untuk preservasi dalam waktu lama, sel harus dibekukan dan disimpan dalam kisaran suhu –50 sampai -80C. Untuk penyimpanan dalam freezer mekanik, sel dipanen pada pertengahan – akhir fase logaritmik dengan sentrifugasi dan dilarutkan dalam medium segar yang terdiri dari 10% (vol/vol) gliserol atau 5% (vol/vol) di-metil sulfoksid (DMSO). Sel yang ditumbuhkan pada agar miring atau plate dapat dipanen dengan cara mengeruk permukaan agar dengan pipet steril setelah direndam dengan media segar yang terdiri dari 10% (vol/vol) gliserol kemudian dibagi ke dalam cryogenic vial atau ampul dan disimpan pada freezer -70C. Mikroba yang disimpan dengan cara ini dapat bertahan sampai 5 tahun.

C. Liquid Nitrogen Freezing and Thawing
Metode ini memerlukan alat khusus untuk mengontrol tingkat pembekuan sebelum disimpan dalam waktu lama dalam nitrogen cair. Media yang digunakan adalah 10 % (vol/vol) gliserol atau 5% (vol/vol) DMSO.

Prosedur pembekuan mikroorganisme dalam nitrogen cair

1. Slant cultures (media agar miring)
 Tambahkan 5 ml cairan nutrien yang terdiri dari 10% (vol/vol) gliserol pada masing-masing slant.
 Keruk permukaan slant dengan pipet steril 1 ml untuk mendapatkan larutan spora.
 Gunakan pipet 2 sampai 5 ml, masukkan masing-masing 1 ml larutan spora ke dalam ampul.
 Tempatkan seluruh ampul dalam pendingin (5C) selama 30 menit.

2. Submerged cultures
 Tambahkan 20% (vol/vol) gliserol ke dalam biakan cair sehingga konsentrasi akhir menjadi 10% (vol/vol).
 Goyangkan tabung perlahan-lahan sehingga tercampur rata.
 Gunakan pipet agar 2 – 5 ml, masukkan masing-masing 1 ml larutan ke dalam ampul 2 ml.
 Letakkan seluruh ampul dalam pendingin (5C) selama 30 menit untuk ekuilibrasi antara sel dan larutan media.


3. Pengontrolan tingkat pembekuan
 Letakkan ampul yang telah ditutup dalam kaleng aluminium yang terdapat dalam wadah yang lebih besar. Kemudian masukkan wadah tersebut ke dalam tabung freezer pengontrol tingkat pembekuan.
 Pertahankan tingkat dingin 1 hingga 2C/menit sampai beberapa derajat dibawah perubahan fase yang didapat. Titik beku biasanya adalah -30C.
 Biasanya nitrogen cair harus ditambahkan ke dalam system, secara manual maupun otomatis, sehingga mendekati titik beku dan perubahan fase akan segera dicapai.
 Setelah sel membeku, atur tingkat dingin lagi hingga 1C/menit sampai kurang lebih mencapai suhu -50C.
 Pindahkan segera ampul kedalam ruang penyimpan akhir dalam pendingin nitrogen cair (- 156 sampai - 196C).

Pencairan
Untuk mencairkan kultur, letakkan ampul dalam water bath dengan suhu 37 - 40C. Gerakkan perlahan-lahan untuk mempercepat pencairan. Usap bagian luar ampul dengan kertas tissue steril yang dibasahi etanol 70% (vol/vol). Pindahklan isi ampul ke dalam tabung reaksi berisi 2 ml air steril, campurkan dengan cara mengocoknya. 0.1 – 0.2 ml diinokulasikan pada media agar miring.

2. FREEZE – DRYING (LYOPHILIZATION)
Freeze – drying meliputi pemindahan air dari larutan sel yang beku dengan sublimasi dengan tekanan rendah. Cara ini merupakan metode paling efektif untuk preservasi mikroorganisme dalam waktu lama. Media yang digunakan adalah skim milk powder 20% (wt/vol) atau sukrosa 12% (wt/vol). Sebagian besar mikroba dapat bertahan dalam media preservasi liofilisasi selama 10 tahun, selain itu untuk pemindahan tidak perlu untuk ditumbuhkan lagi dalam agar miring atau dicairkan.

A. Proses dan Peralatan Freeze-Drying
Alat freeze-drying terdiri dari (1) ruang freeze-drying yang berupa pipa dengan mulut banyak, (2) kondensor dan (3) pompa vacuum.
B. Prosedur Freeze-drying
 Tambahkan 20% (wt/vol) skim milk (disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121C selama 15 menit) ke dalam masing-masing kultur miring. Kerik permukaan slant dengan pipet steril untuk menghomogenkan larutan spora.
 Masukkan 0.2 ml dari larutan spora ke dalam masing-masing ampul steril dan tutup kembali dengan kapas.
 Setelah semua larutan dimasukkan ke dalam ampul, bekukan di dalam freezer selama kurang lebih 2 jam, masukkan ampul kedalam liofiliser dan biarkan selama 16 jam (sampai kering).

C. Penyimpanan
Kultur yang sudah di freeze-dried disimpan pada suhu di bawah 5C.

3. MACAM-MACAM METODE PRESERVASI
Metode lain selain freezing dan freeze drying yang sering digunakan adalah :
A. Subculturing
Yaitu dengan cara memindahkan kultur ke media agar segar secara periodik, kemudian diinkubasikan pada suhu yang sesuai untuk pertumbuhannya. Metode ini tidak menyusahkan dan tidak mahal, serta tidak memerlukan peralatan khusus. Kultur pada agar miring harus disimpan dalam lemari pendingin (5 C) dalam wadah tertutup untuk menghindarkan dari kekeringan dan meminimalkan aktivitas metabolismenya. Cara ini tidak sesuai untuk pemeliharaan strain dalam waktu lama.

B. Immersion in Mineral Oil
Cara sederhana untuk preservasi strain mikroba adalah dengan mencelupkan kultur (agar miring atau kultur cair) kedalam minyak mineral dan menyimpannya dengan posisi tegak lurus pada suhu 25 C. Minyak disterilisasikan dalam oven dengan suhu 170 C selama 1 – 2 jam. Kultur direndam dibawah minyak dan dengan mudah dapat ditumbuhkan kembali pada media segar memakai jarum inokulasi.

C. Drying
Spora penyusun fungi dan Streptomyces dapat dipreservasi dengan metode drying (pengeringan) spora pada permukaan bahan padat inert, seperti silica gel atau glass bead. Tanah dan silica gel dicuci dan dimasukkan ke dalam tabung. Tabung disterilisasi dengan autoklaf dan dikeringkan pada suhu 25C.

Pengeringan dalam tanah (Greene)
1 ml larutan konidia dimasukkan ke dalam 5 g tanah steril . Tabung berisi tanah yang telah diinokulasi dikeringkan perlahan-lahan pada suhu 25 C, ditutup dengan sumbat kertas serap. Untuk memanen fungi dalam kondisi aktif, hanya perlu mengambil sedikit secara aseptis dan di sebarkan pada media agar miring.

Pengeringan dalam silica gel
1. Isi tabung setengahnya dengan silica gel
2. Tabung disterilisasi kering pada suhu 180 C selama 1.5 jam dan simpan rapat dalam wadah tertutup.
3. Siapkan konidia yang lebat atau larutan vegetatif dari kultur miring segar, gunakan 1 – 2 ml 10% (vol/vol) skim milk.
4. Teteskan  0.5 ml larutan ke dalam masing-masing tabung berisi silica gel.
5. Kocok tabung untuk melepaskan butiran-butiran silica gel.
6. Setelah dikeringkan pada suhu 25 C, simpan dalam wadah tertutup.

Pengeringan dalam butiran porselen (J.Lederberg)
1. Masukkan 10 – 12 butir porselen ke dalam botol vial kecil (10 ml).
2. Autoklaf vial pada suhu 121C selama 15 menit.
3. Larutan sel didapat dari kultur miring (24 –48 jam) yang diberi 20% (wt/vol) larutan sukrosa.
4. Secara aseptis pindahkan butiran porselen ke petri dish steril dan inokulsikan dengan 1 tetes larutan sel.
5. Pindahkan butiran porselen yang sudah diinokulasi ke dalam botol vial, masing berisi 10 – 12 butir.
6. Tutup vial dengan sumbat steril.
7. Keringkan dengan vacuum desiccator selama 72 sampai 96 jam.
8. Simpan botol vial dalam lemari besi yang mengandung pengawet Drierite pada suhu 25C.



PENGENDALIAN PERTUMBUHAN MIKROORGANISME

DAN

PRESERVASI MIKROBIOLOGI INDUSTRI*




oleh:

Ahmad Marasabessy
Diyah N. Hidayati















Balai Pengkajian Bioteknologi
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi
Oktober 2002

*Disampaikan pada Pelatihan Mikrobiologi Industri untuk PT Coca Cola Indonesia
di Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Kawasan Puspiptek – Serpong 15314
Tangerang, tanggal 23 – 25 Oktober 2002